PCR扩增的特异性主要取决于引物与目标DNA序列结合的精准性，同时也受到多种反应条件和组分的影响?。以下是影响PCR特异性的关键因素：
引物设计与质量
PCR的特异性?首要取决于引物??。引物需要与目标DNA序列高度互补，其设计需满足以下要求：
?GC含量?：建议在40%-60%之间?
?长度?：通常为18-25个碱基?
?避免二聚体/发夹结构?：这些结构会降低引物与模板的结合效率?
?引物浓度?：浓度过高易导致非特异性扩增和引物二聚体形成?
反应条件优化
退火温度
退火温度是影响特异性的关键参数?。温度过高会导致引物无法结合，温度过低则会引起非特异性结合。通常根据引物的Tm值（解链温度）来设定，一般比Tm值低3-5℃?。
Mg2?浓度
Mg2?浓度显著影响PCR的特异性和产量?
?最佳范围?：1.5-2.5 mmol/L?
?过高影响?：浓度过高会降低特异性，增加非特异性扩增?
?优化方法?：可从1 mmol/L到3 mmol/L，以0.5 mmol/L梯度进行优化
循环参数
?循环次数?：一般30-40次?
。循环次数过多会导致非特异性产物积累?
?延伸时间?：时间过短可能导致长片段合成失败?
反应组分
dNTPs浓度
dNTPs浓度需要优化?
?推荐浓度?：0.2 mmol/L?
?过高影响?：浓度过高会抑制酶活性并增加错误掺入率?
DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的用量需要精确控制?
?用量范围?：0.5-5 U/100 µL反应体系
?过量影响?：酶量过高可能增加非特异产物?
模板质量与浓度
模板DNA的纯度和浓度直接影响扩增效果?
?纯度要求?：不能含有蛋白酶、离子螯合剂等抑制物?
?浓度优化?：质粒DNA需0.1-1 ng，基因组DNA需5-50 ng?
?浓度影响?：模板量过高易引起非特异性扩增?
其他影响因素
?缓冲体系?：Tris-HCl缓冲液的pH值（8.3-8.8）和离子强度影响酶活性和DNA稳定性?
?PCR抑制物?：如肝素、EDTA、酚类物质会干扰反应?
?温度控制?：变性不（温度<94℃或时间不足）会导致模板复制不?
